本发明公开一种生物基稠油降黏剂及其制备方法和应用，所述降黏剂由降黏组分和防腐剂组成；降黏组分以质量百分比计，含80‑95%鼠李糖脂发酵液上清液和5‑20%生物乳化剂发酵液；鼠李糖脂发酵液上清液中鼠李糖脂浓度为2‑5%，其中双鼠李糖脂结构组分≥65%；鼠李糖脂发酵液中含有植物油脂水解产物脂肪酸钠；所述生物乳化剂发酵液为含乳化功能蛋白的重组菌的发酵液。本发明的生物基稠油降粘剂通过微生物发酵获得鼠李糖脂作为表面活性剂成分，同时经复配生物乳化剂制得全生物基稠油降粘剂，其与现有化学降粘剂相比，具有较强的耐盐、耐高温、有效降低油水界面张力、降低表面张力的特点，对稠油降黏效果能够达到80%~99%，安全环保，并能够有效降低成本。