本发明公开了一种基于聚丙烯胺盐酸盐介导的铜生长增强检测大肠杆菌O157:H7试剂盒及检测方法。该试剂盒包括免疫层析试纸条、金标抗体、聚丙烯胺盐酸盐溶液、铜离子溶液和抗坏血酸溶液；所述的免疫层析试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述的硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述的检测线喷涂抗大肠杆菌O157:H7捕获抗体，所述的质控线喷涂羊抗鼠抗体。采用本发明的试剂盒及检测方法可以消除硝酸纤维素膜和铜金属离子间的非特异性，从而提高检测稳定性，并提供最大化且有效的信噪比，实现了对大肠杆菌O157:H7的高灵敏度检测。