本发明的新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质制备及定值的方法，它包括：新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白原料的纯化与稀释；新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质候选物溶液的均匀性初检与分装；对分装单元中的新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质候选物溶液理化性质的表征；对分装单元中的新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质的均匀性和稳定性检验；新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质中N蛋白含量标准值的测定，新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质标准值的确定和统计检验；新型冠状病毒核衣壳蛋白N蛋白标准物质标准值定值结果的不确定度评定。