本发明属于植物病毒学检测技术领域，具体涉及一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法，包括以下几个步骤：(1)设计用于扩增黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)2种病毒基因片段的特异性引物；(2)提取样本总RNA；(3)含病毒RNA的烟草植物总RNA样品高温变性作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；(4)利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；(5)将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本检测体系通过一次PCR反应，就可以鉴定出复合侵染的多种病毒，适合基层检测站点快速和高效地鉴定大批量烟叶样品，为后续的被侵染烟株的提早发现和抗病毒遗传育种等病毒防控工作打下了基础。