本发明公开了一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用，本发明的制备步骤包括：(1)犬胎盘组织的采集及用保存液低温运输；(2)用清洗液进行洗涤，用绞碎器进行组织绞碎；(3)加入消化液进行消化；(4)通过离心收集细胞；(5)用生长培养基培养细胞及传代；(6)检测合格后冻存备用。本发明方法操作简单，方便实用，效率高，能够极大的提高原代细胞的收获量，所用生长培养基能够促进细胞的快速增殖，维持细胞的干性。本发明所获得的间充质干细胞能够治疗犬科动物疾病，包括皮肤缺损、烧烫伤、脓皮病、骨关节炎、股骨头坏死、急性肾损伤、药物性肝损伤、结肠炎、再生障碍性贫血、角膜炎、结膜炎、干眼症、口炎等。