本发明公开了大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明提供了大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。本发明进一步提供了采用所述靶基因片段构建的Gateway干扰载体。本发明提供的大丽轮枝菌VdNRPS2基因抗病原菌靶基因片段以及采用该靶基因片段所构建的Gateway干扰载体能应用于提高作物对大丽轮枝菌所导致病害的抗性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种等方面。