本发明提供了一种人多能干细胞冻存液，包括基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物，所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR‑99021，ID‑8和Y‑27632，且人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。本发明的人多能干细胞冻存液，通过3种信号通路抑制剂的协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，冻存细胞后复苏，具有较高的复苏后细胞活率。此外，本发明的人多能干细胞冻存液冻存时不需要程序性降温，更加快速简便。本发明的人多能干细胞冻存液质量研究充分，产品性能高，成本低廉，适用于不同培养基。