本发明公开了一株H9N2亚型禽流感病毒MDCK细胞冷适应减毒活疫苗株及其应用，属于兽用药物领域。所述冷适应减毒活疫苗株保藏编号为CCTCC NO:V202240。所述冷适应减毒活疫苗株的培育方法，包括：以一株H9N2亚型禽流感流行毒株作为亲本毒株，在MDCK细胞中梯度降温培育获得冷适应减毒活疫苗株。本发明公开的冷适应减毒活疫苗株的培育方法可以摆脱对鸡胚的依赖，而且所培育的冷适应减毒活疫苗株可以刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，从而保护家禽不受H9N2禽流感病毒的侵扰。