本发明公开了血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法，其包括：步骤一、获得富集分子量低于65kDa蛋白的预处理样品；步骤二、对预处理样品进行质谱DDA模式采集数据；步骤三、利用步骤二中两次质谱DDA模式采集数据建立蛋白信息库；步骤四、采用质谱DIA模式采集对分子量小于65kDa蛋白的待测样品进行测定，得到待测样品的DIA原始数据；步骤五、将步骤四得到的DIA原始数据与步骤三得到的蛋白信息库进行匹配得到待测样品的蛋白含量。本发明可重复稳定地进行血清/血浆中的分子量小于65kDa蛋白的定量分析。