本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用，所述抗虫性的苏铁毒蛋白基因及其同源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5。本发明提供的毒蛋白基因来自苏铁，外源表达注射发现其对小菜蛾与棉铃虫幼虫具有毒性作用。将其导入到棉花中，使棉花获得草地贪夜蛾和棉铃虫抗性，且后代能够稳定遗传。本发明为抗虫植物的研制提供了一种新的抗虫基因，不仅可以使棉花等受体获得多种机制的抗虫性，还利用基因互补的方式加强转基因棉花的抗虫能力，延缓害虫产生抗性，拓宽了棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。