本发明公开了一种负载间充质干细胞外基质的3D打印骨缺损修复支架，制备步骤如下：S1.将明胶、海藻酸钠和58S生物玻璃溶于水中获得溶液，溶液搅拌均匀，获得3D打印浆料，然后进行3D打印；打印成品先用氯化钙溶液进行化学交联，后浸泡于戊二醛溶液中化学交联；最后清洗，冻干即得3D打印支架；S2.将3D打印支架进行消毒处理；S3.将rBMSC细胞悬液以至少106个/孔的浓度接种于支架上，使用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养2周；S4.取出支架，进行脱细胞处理，冻干即得。本发明制备的负载间充质干细胞外基质的3D打印骨缺损修复支架应用于骨缺损修复，能够有效促进骨组织及血管组织形成，明显提高骨缺损修复的效率。