本发明公开了一种烟草提取物的制备工艺、烟草提取物，以及一种烟草提取物的应用，其中种烟草提取物的制备工艺包括以下步骤：混料：将烟草原料与碱液混合，获得固液混合料，其中固液混合料的pH值≥8；提取和分离：将上述固液混合料加入超临界CO2萃取设备中进行提取和分离，其中超临界CO2萃取设备包括萃取釜、第一分离釜、第二分离釜和第三分离釜，固液混合料进入萃取釜进行提取，获得提取液；之后提取液再依次进入第一分离釜、第二分离釜和第三分离釜进行分离；通过第一分离釜分离出蜡脂，通过第二分离釜分离出香料，通过第三分离釜分离出烟碱。本发明的烟草提取的制备工艺能够实现对烟草中蜡脂、香料和烟碱的一次性提取和分离，方便高效。