本发明公开了一种抗EV71病毒中和抗体及其制备方法和应用，所述抗EV71病毒中和抗体的重链互补决定区具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述抗体的轻链的互补决定区具有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本发明的抗EV71病毒中和抗体能够识别EV71‑VP1蛋白的空间表位，不识别线性表位，具有良好的中和效果，对进一步开展EV71病毒感染疾病机制研究与防控策略制定有重要意义。