本发明提供了一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用，所述突变株为AZC_0343基因缺失的茎瘤固氮根瘤菌；本发明以茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA为模板，分别以引物0343‑up‑F/R、0343‑down‑F/R扩增AZC_0343基因的上游片段和下游片段；将扩增产物酶切酶连构建重组质粒，然后将重组质粒导入大肠杆菌，并通过三亲接合方法导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；最后筛选得到所述突变株。本发明所述突变株的固氮能力显著，其固氮酶活性比野生株提升了88.56％，且所述突变株可以增加土壤养分、提高肥料有效性，促进玉米生长，具有开发成微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。