本发明公开了一种益生菌米酒曲的制备方法及其应用，其制备包括如下步骤：配制MRS液体培养基；将0.05％益生菌菌粉接入MRS液体培养基内进行培养，得到益生菌菌液；挑选颗粒饱满的糯米，清洗后加入足量的水，开始浸泡；将浸泡后的糯米沥干后于容器中蒸至外硬内软，内无白心，疏松而不烂，得到糯米饭；用凉开水将糯米饭降温后，调节其水分，向糯米饭中分别添加糖化酶、益生菌菌液，搅拌均匀；将糯米饭放入恒温培养箱中发酵，过滤米醪后，得到益生菌米酒；将益生菌米酒和大米粉混合，进行烘干、粉碎后，得到益生菌米酒曲。本发明的益生菌米酒曲可适于益生菌米酒的工业化大生产，益生菌多，对人体有营养保健作用，对米酒行业的创新发展具有极其深远的意义。