本发明公开了HPLC分离核苷三磷酸和/或脱氧核苷三磷酸的方法。该方法包括：将待测样品进行HPLC检测，待测样品选自腺苷‑5′‑三磷酸、胞苷‑5′‑三磷酸、鸟苷‑5′‑三磷酸、尿苷‑5′‑三磷酸、2′‑脱氧腺苷‑5′‑三磷酸、2′‑脱氧胞苷‑5′‑三磷酸、2′‑脱氧鸟苷‑5′‑三磷酸、2′‑脱氧胸苷‑5′‑三磷酸、2′‑脱氧尿苷‑5′‑三磷酸的中的至少一种；以磷酸三乙胺溶液和乙腈的混合液为流动相或以磷酸三乙胺溶液和甲醇的混合液为流动相；色谱柱为C18柱。可实现在短时间内完全分离核苷三磷酸以及脱氧核苷三磷酸。采用该方法获得的结果精密度高，稳定性好，重现性好。