本发明涉及一种适用于3D打印的多功能甘油水凝胶生物墨水的制备方法。该制备方法包括：将明胶和硝酸钙溶于水中，搅拌，凝胶化，得到明胶水凝胶，放入含戊二醛的硫酸铵水溶液中反应，冲洗，浸泡在甘油和硫酸铵水溶液的混合溶液中，通过溶剂置换，得到交联的明胶甘油水凝胶，熔化并冷却至室温后，与3T3细胞或ADSC细胞混合。该方法制备得到的甘油水凝胶生物墨水具有较好的抑菌效果、稳定性、机械性、抗干燥性、抗冻性、形状保真度等一系列有利特性，并且在3D生物打印和冷冻保存过程中能够实现细胞保护，打印的组织也可以直接冷冻保存而无需添加冷冻保护剂，这在实际的生物医学应用中无疑具有广阔的前景。