本发明提供了结膜下成纤维细胞脱细胞基质在结膜重建方面的应用。本发明公开了结膜下成纤维细胞脱细胞基质促进结膜上皮细胞的生长和增殖；维持结膜上皮干细胞特性；维持结膜上皮干细胞在体外分化过程中notch通路的活性和wnt通路的抑制状态；促进大面积结膜缺损的修复；促进结膜缺损修复后杯状细胞和黏蛋白的表达；减轻结膜缺损修复后基质层的纤维化和瘢痕化水平。本发明制备得到的结膜下成纤维细胞脱细胞基质为无色透明薄膜，具备一定的机械强度和可拉伸性，能够耐受外科针线缝合，可构建厚度明显优于脂肪间充质干细胞来源的脱细胞基质，杨氏模量与正常结膜组织接近，便于临床推广。