本发明公开了一种尼卡巴嗪代谢物半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的尼卡巴嗪代谢物半抗原，合成方法简单、纯度高、产率高。将该尼卡巴嗪代谢物半抗原分别与血蓝蛋白和卵清蛋白偶联，分别作为免疫原和包被原。所述免疫原免疫动物制备得到尼卡巴嗪代谢物单克隆抗体，结合所述包被原和羊抗鼠IgG，用于制备尼卡巴嗪代谢物酶联免疫试剂盒、尼卡巴嗪代谢物胶体金检测试剂盒和尼卡巴嗪代谢物时间分辨荧光定量检测试剂盒。上述试剂盒用于检测动物肉和蛋类等样品中的尼卡巴嗪代谢物，灵敏度高、重复性好、准确性好、特异性高，在常温下保存期达一年。