本发明属于固定化脂肪酶酶蛋白检测技术领域，公开了一种基于近红外光谱检测固定化脂肪酶酶蛋白含量的方法，步骤包括：S1对脂肪酶进行固定化，利用考马斯亮蓝法和烘干法确定固定化酶中酶蛋白含量；S2对步骤S1已测定酶蛋白含量的固定化脂肪酶样品不预处理或预处理，采集其近红外光谱，选取特征波段下的光谱信息，建立近红外光谱与酶蛋白含量之间的定量校准模型，对其预测性能进行评价；S3采集待测固定化脂肪酶样品近红外光谱，选取特征波段下的光谱信息，导入定量校准模型，获得待测固定化脂肪酶样品酶蛋白含量。本发明引入近红外光谱技术实现了对固定化脂肪酶酶蛋白含量的快速、无破坏检测，方法操作简单、具有高准确性和高精确度的优点。