本申请提供了一种磁性微球及其制备方法、应用和诊断试剂盒，其中的磁性微球包括磁性聚合物基球；聚合物包覆层，包覆在所述磁性聚合物基球的表面，所述聚合物包覆层的表面连接有主链长度不同的第一碳链和第二碳链，所述第一碳链的主链末端含有磺酰系基团，所述第二碳链的主链末端含有羟基。通过将磺酰系基团和羟基在磁性微球表明形成错层结构分布，可有利于磺酰系基团和羟基在磁性微球表面的均匀分布，提高磁性微球表面的亲水性；并且磺酰系基团在磁性微球表面的分布更均匀，可提高磺酰系基团对特异性蛋白和抗体的吸附效率，降低对非目标蛋白或抗体的非特异性吸附。