本发明提供一种分子印迹膜及其制备方法和应用。该制备方法包括：对聚酰胺薄膜进行预处理，使其分子中的仲胺接枝第一功能单体，得到聚酰胺接枝膜；将模板分子、第二功能单体、交联剂与引发剂混合，得到预聚液，其中模板分子为异荭草苷；将聚酰胺接枝膜与预聚液接触，得到吸附有预聚液的聚酰胺接枝膜；在隔绝氧气的条件下，使聚酰胺接枝膜吸附的预聚液中的功能单体发生聚合反应，然后去除其中的模板分子，得到分子印迹膜。采用上述制备方法得到的分子印迹膜，对于异荭草苷具有较高的选择识别能力，能够有效分离、提纯提取液中的异荭草苷。