本发明提供了一种毒素四项微阵列芯片酶标板及其制备方法与应用，属于毒素检测技术领域。本发明提供的毒素四项微阵列芯片酶标板的每个样品孔中都含有生物分子识别位点，所述生物分子识别位点分别包被有质控蛋白、黄曲霉毒素抗原、玉米赤酶稀酮抗原、呕吐毒素抗原和伏马毒素抗原，所用包被液由0.01M PB pH7.5和1％浓度甘油组成。本发明提供的毒素四项微阵列芯片酶标板能对单个样本中四种毒素同时进行定量检测，与传统的ELISA相比能最大限度地减少工作强度，具有高通量、多指标、微量化、智能化、可视化和低成本的优势。