本公开提供了一种细菌代谢物分析方法，可以应用于生物质谱分析领域。该方法包括：利用以包含目标原子的化合物作为细菌生长摄入原料的对照组培养基，和利用同位素替换目标原子的化合物作为细菌生长摄入原料的实验组培养基培养细菌，得到对照组细菌和实验组细菌；对对照组细菌和实验组细菌质谱检测，得到对照组质谱图和实验组质谱图；针对对照组质谱图中的每个对照质谱峰，匹配对应的候选代谢物，得到初始代谢物列表；从实验组质谱图中确定与对照质谱峰对应的同位素质谱峰；根据对照质谱峰、同位素质谱峰和目标原子，确定原子数量；利用原子数量筛选初始代谢物列表，得到最终代谢物列表，以便于根据最终代谢物列表进行细菌代谢物分析。