本发明公开了一种应用在开放场景下的浮游生物原位成像系统及方法，该系统包括：远心光源、二向色分光镜、背影成像模块、荧光成像模块、控制模块和图像处理模块；远心光源入射水体中浮游生物平面，含有叶绿素的浮游生物目标在远心光源发射的光激发下发射出更长波长的荧光成分，与照明光混叠在一起，所述二向色分光镜将二者进行分离；背影成像模块对分离出的照明光进行背影成像，荧光成像模块对分离出的荧光进行荧光成像；控制模块控制背影成像模块和荧光成像模块同时进行触发，实现对同一视野的背光图像与荧光图像的同频率采样。本发明能够实现对微型浮游生物的有效观测。