本发明公开了一种荧光编码微球、制备方法和应用、诊断试剂盒。该荧光编码微球包括：聚苯乙烯微球；具有不同的最大发射波长的第一荧光染料和第二荧光染料，包覆在所述聚苯乙烯微球的内部；所述第一荧光染料和所述第二荧光染料各自独立地具有如下结构式I所示的结构，其中的R选自取代或未取代的具有5至10个环原子的芳香基团；所述荧光染料的最大发射波长为650~850nm。由于荧光染料的最大发射波长为650~850nm，将荧光编码微球与流式细胞仪联用时，荧光编码微球发射的荧光并不能被流式细胞仪的FITC通道和PE通道捕捉，从而荧光编码微球发射的荧光并不会影响FITC通道和PE通道的后续测定，提高了测定结果的准确度。