本发明公开了一种实时调控酶活制备高活性透明质酸寡糖组合物的方法，属于透明质酸寡糖技术领域，所述方法包括：酶解，层析纯化，纳滤，除菌与物料干燥；该方法制备的产品具有结构完好，生物活性高，纯度高，含量可达95%以上，回收率高，效率高，是一种绿色低碳经济效益非常高的工业化方法。本发明制备的寡糖具有明显的透皮吸收效果；可以显著降低氧化应激细胞内活性氧的含量、显著提高细胞内过氧化氢酶的酶活力；有效防止细胞内脂质氧化水平的提高、提高细胞内一型胶原的含量、提高细胞内透明质酸的含量；可以显著降低炎症因子。本发明制备的产品可以广泛的应用于食品、化妆品、药品、医疗器械等领域。