本发明公开了一种香榧籽油中多种高纯度不饱和脂肪酸的分离方法，所述分离方法解决了现有技术分离物单一及成本高的问题。所公开的方案采用碱溶液对样品进行水解，酸化后直接通过萃取获得粗提物，通过一次逆流色谱分离便实现了香榧籽油中金松酸、油酸、亚油酸以及二十碳二烯酸多种不饱和脂肪酸成分的分离纯化，有效地缩短了分离制备的时间；并且该方法不仅成本低，而且操作简单可靠，为香榧籽油中不饱和脂肪酸的开发利用提供了技术支撑，具有较好的应用价值。