本发明公开一种基于飞行时间质谱的同时检测26个耳聋易感基因突变位点的试剂盒及其应用。本发明提供的引物组能同时对26个耳聋易感基因突变位点进行检测，分析人类遗传性耳聋特异性的SNP位点的基因型情况，对样本中4个人类遗传性耳聋易感基因的SNP点突变、短片段突变和线粒体基因组的点突变能进行准确分型，具有高准确性、高灵敏度和重复性；克服了现有技术中单管反应检测SNP位点较少的缺陷，通过多次引物序列优化，避免多对引物之间的相关干扰。采用更少的引物对能同时扩增多个突变位点，更加全面地涵盖更多突变范围，并且检测耗时少，简化操作，降低成本，结果直观容易判断，能够进行更有效的遗传性耳聋检测。