本发明涉及一种滇中地区草莓脱毒种源快速构建与扩繁的方法，属于农业技术领域，本发明技术利用滇中地区气候优势，通过闷棚热处理和人工补光提早草莓匍匐茎萌发和生长，将茎尖生长点剥取提前至4月；可显著提高生长点剥取、培养和脱毒效率；当年7月获得脱毒生根苗并作为母株定植开始第一轮扩繁，至11月底采收子苗扦插生根；第二年2月和6月分别用上一轮扩繁的子苗作为母株，进行第二轮和第三轮扩繁，至年底头年构建的1株脱毒种源可扩繁脱毒种苗10万株以上。本发明显著提高了脱毒种源构建效率，避免瓶内扩繁潜在的变异风险；能提前完成脱毒种源构建，高效安排扩繁茬口，可在提高扩繁效率的同时有效降低生产成本。