本发明公开了用于乳腺癌检测的生物标志物、试剂盒及其应用。具体地公开了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质在乳腺癌基因检测中的应用，所述生物标志物包括13个基因的突变位点：AKT1、EGFR、ERBB2、ERBB3、ESR1、FBXW7、KRAS、MTOR、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、SF3B1和TP53。本发明还公开了乳腺癌基因突变的检测方法，该方法涵盖了13个基因的173个突变位点，通过设计引物panel，使检测的反应数降低，以较少的引物实现更多种基因多个突变位点的同时覆盖，并且该方法仅通过一轮PCR扩增即完成建库，操作时间短，并且灵敏性高，可以达到0.2％。