本发明涉及基因工程的技术领域，尤其涉及一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌及其构建方法和应用，所述工程菌以熊蜂生假丝酵母菌为出发菌株，用gF‑Hph‑gR核苷酸序列取代槐糖脂合成路径中调控内酯化反应的基因序列seq2，其中，所述gF‑Hph‑gR核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述seq2基因序列为SEQ ID No.2，本发明所提供的采用融合pcr的方法构建带有抗性筛选标记的seq2基因敲除盒，最短1天时间即可获得,这为高效构建槐糖脂生产工程菌株提供了新途径，本发明所提供的高产槐糖脂的基因敲除菌株也为大规模工业化生产槐糖脂，满足市场需求奠定了基础，应用前景、经济价值和社会效益广阔。