本发明公开了一种烟草根结线虫的室内培养方法，涉及烟草根结线虫培养技术领域，解决了现有技术中烟草根结线虫的繁殖与培养依赖于活体寄主植物、需要温室、土壤及易感植物品种，涉及实验材料多、操作繁琐、周期长、不易管理的技术问题。本发明烟草根结线虫的室内培养方法，包括如下步骤：禾谷镰刀菌的分离纯化及培养、禾谷镰刀菌种子液制备、用于培养烟草根结线虫的禾谷镰刀菌平板的制作、通过过筛法筛选得到烟草根结线虫虫卵和烟草根结线虫、接种并培养烟草根结线虫。本发明烟草根结线虫的室内培养方法，具有简便、快捷，能够大量获取植物烟草根结线虫的优势，能够在很大程度为室内筛选烟草根结线虫生防菌及其化学农药提供了测试对象。