本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶突变体及其应用，该突变体利用SEQ IDNO.1所示氨基酸序列，对氨基酸序列中第31、33、171、194、197位进行单点或多点突变获得。利用本发明的D‑氨基酸氧化酶突变体及其固定化酶应用于D‑草铵膦的氧化反应，相比野生型的D‑氨基酸氧化酶其优势在于：催化活性提高了1200倍，底物转化率＞99.6％以上，固定化酶反应批次至少可以使用10批次以上且反应时间无延长，同时固定化酶活力无损失，可满足工业化生产应用要求。