本发明公开了一种超高效液相高分辨质谱非靶标代谢组学的检测方法，包括以下步骤：代谢物提取，上机检测和数据处理，本发明采用超高效液相色谱与高分辨质谱仪联用，可以改善低浓度代谢物检测的全面性，提高检测的准确度。并且采用包含25mmol/L乙酸铵和25mmol/L氨水的水溶液作为A相，可以改善检测系统的稳定性。同时采用2.1mm×100mm,1.7μm规格的色谱柱，可以很好的控制物质的残留，使样品间的交叉污染控制在可控范围。本发明的内标在QC样品中的保留时间和响应强度稳定性很好，仪器数据采集稳定性很好。