本发明属于生物医药工程技术领域，公开了一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系的构建。所述构建方法为：在PEDV的S1基因序列起始密码子ATG之前添加Kozac序列，在序列N端设计小鼠IgGκ链信号肽序列，在肽链C端设计1个Strep标签，并以柔性Linker与目的蛋白相连接，得到改造后的序列，然后克隆至慢病毒包装载体，转染至293T细胞培养，收获慢病毒包装病毒液加入到CHO细胞中进行筛选培养，得到稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白CHO细胞系。本发明所得CHO单克隆细胞株连续传20代后仍能表达PEDVS1重组蛋白，且重组蛋白的回收率和纯度显著提高。