本发明属于细胞悬液制备技术领域。针对现有方法制备的冷水鱼鳃组织的单细胞悬液维持高活性的时间较短的问题，提供冷水鱼鳃组织单细胞悬液的制备方法及应用。通过冷水鱼心脏灌流PBS的方法，去除鳃组织中多余的红细胞，将鳃组织剪成匀浆状，离心，弃掉上清液，加入胶原酶II溶液，12～18℃连续360°旋转，至组织完全消化解离，用细胞筛过滤，离心，弃掉上清液，制得所述冷水鱼鳃组织单细胞单细胞悬液。本发明所述方法酶解更为充分，实验耗时短，操作步骤简便。所获细胞形态完整，细胞浓度高，细胞活性在90％以上，结团率低于10％。细胞稳定性较好，4℃环境条件下可保存6h左右，能够充分满足各类单细胞测序平台文库构建的需求。