本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsHOX3基因制备改良水稻的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明根据OsHOX3基因设计靶标序列，采用CRISPR/Cas9对OsHOX3基因的第一外显子进行人工突变，并筛选出功能缺失突变体。OsHOX3突变体植株穗数和穗粒数增加，穗结构得到优化，一次枝梗数增加而二次枝梗数减少，同时籽粒变得细长和垩白降低，表明OsHOX3参与改善水稻产量和稻米外观品质。OsHOX3基因可作为水稻种质资源的遗传改良育种的重要资源，有助于水稻产量和外观品质的提升。