本发明属于酶活性检测技术领域，具体涉及一种基于荧光检测的短链脱氢还原酶(SDR酶)活性的高通量测定方法及其应用。所述高通量测定方法包括以下步骤：(1)SDR粗酶的表达；(2)SDR粗酶中SDR目标蛋白的提取；(3)NADH的荧光信号检测，以确定所述SDR酶活性；其中，优选地，所述测定方法是在96孔板中进行的。本发明提供的基于荧光检测的SDR酶活性的高通量测定方法通量高、灵敏度高、操作方便、成本低廉，为快速、高效筛选SDR酶突变体的催化活性，提高SDR酶筛选过程中的定向进化效率提供了新方法，具有广阔的应用前景。