本发明提供了一种具有辅助增强抑制肿瘤转移作用的灵芝孢子油制备方法，属于生物技术领域。本发明的制备方法主要步聚为：1）未破壁灵芝孢子粉分别经乙醇、水处理、离心，离心分离所得的灵芝孢子粉再经喷雾干燥、低温物理破壁，制得净化后的破壁灵芝孢子粉；2）、净化后的破壁灵芝孢子粉经制粒、烘干，然后再采用超临界二氧化碳萃取，制得灵芝孢子油。该方法去除了灵芝孢子粉壁壳中的残留有害物质和脂溶性杂质，制得的灵芝孢子油无塑化剂残留、无农药残留，总三萜、麦角甾醇等的含量高，酸价、过氧化值低，提高了灵芝孢子油的品质。经动物学实验证明，该方法制备的灵芝孢子油具有辅助增强抑制肿瘤转移作用和提高机体免疫能力的功效。