本发明属于烟草黑胫病分子鉴定领域。针对黑胫病生理小种的鉴定方法，存在鉴定程序繁琐、鉴定结果不准确的缺点，提供一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对及其应用。引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。提取待鉴定样本的基因组DNA并作为模板，利用以上所述的引物对对基因组DNA中的基因片段HJ0进行PCR扩增，HJ0的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；对扩增产物进行检测，若出现167bp的DNA条带，则待测样本为0号生理小种。本发明提供的PCR引物对的特异性好，鉴定烟草黑胫病0号生理小种的准确性高，方法简单高效，解决了黑胫病生理小种的鉴定难题。