本发明公开了一种具有改善骨关节健康作用的非变性II型胶原蛋白的制备方法与应用，涉及食品生物技术领域。一种非变性II型胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1、将软骨碎与含NaOH和NaCl的混合溶液混合，进行杀菌脱杂处理，固液分离，得杀菌脱杂后软骨碎；S2、将所述杀菌脱杂后软骨碎与水混合后进行均浆处理，得均浆液；S3、将所述均浆液的pH调至1.5～3后，进行酶解处理，固液分离，得酶解清液；S4、将所述酶解清液的pH调至4.0～6.5后，固液分离，将固相干燥、粉碎，即得非变性II型胶原蛋白。该制备方法的蛋白提取率高，且提取得到的蛋白纯度高。