本发明涉及甲状腺癌良恶性结节诊断的甲基化标志物及其应用，具体涉及检测一个或多个目标标志物的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平的试剂在制备诊断个体甲状腺结节良恶性的检测试剂或诊断试剂盒中的应用，以及用于确定下述一个或多个目标标志物的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平的装置在制备诊断个体甲状腺结节良恶性的诊断试剂盒中的应用，所述目标标志物包括PRDM16基因或基因组的PRDM16序列、CAMK2N1基因或基因组的CAMK2N1序列、TACSTD2基因或基因组的TACSTD2序列等。本发明还包括检测目标标志物中至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或甲基化水平以诊断甲状腺结节良恶性的诊断试剂或诊断试剂盒。