本发明公开了一种高纯度杜仲叶总黄酮的制备方法及在抗骨质疏松方面的应用，涉及生物医药领域。该制备方法包括先将杜仲叶粉碎后加入质量分数为55％‑65％的乙醇溶液中，浸泡0.5‑5h，闪式提取2次，过滤后将滤液减压浓缩和冷冻干燥后，经NKA‑9型大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化，得到杜仲叶总黄酮。本发明所提供的杜仲叶总黄酮可以有效提高峰值骨量大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和骨形成指标血清骨钙素水平，可降低骨小梁分离度和骨吸收指标血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b活性，还可提高大鼠的骨形成和抑制骨吸收，进而影响骨代谢，表明杜仲叶总黄酮的抗骨质疏松效果显著，可作为一种潜在的抗骨质疏松药物。