本发明公开了非洲猪瘟H240R表位肽、单克隆抗体及其应用，涉及分子免疫学技术领域。所述非洲猪瘟H240R表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。所述单克隆抗体为单克隆抗体11C1A6或单克隆抗体38A3B2；所述单克隆抗体11C1A6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9‑10所示；所述单克隆抗体38A3B2的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11‑12所示。本发明鉴定得到了非洲猪瘟H240R表位肽，并制备得到了与非洲猪瘟H240R蛋白特异性结合的单克隆抗体，为制备非洲猪瘟多肽疫苗和检测试剂盒奠定了基础。