本发明公开了一种基于原位裂解和脉冲凝胶电泳相结合的叶绿体环状基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）待提取作物的预处理，得到用于叶绿体细胞器提取的叶片；（2）将叶片快速浸入ET‑M‑D体系中10~20min，用W5‑3溶液清洗三次后，通过等差离心法和密度梯度离心法去除杂物，得到叶绿体粗提溶液；所述ET‑M‑D体系包括以下终浓度的成分：0.6M甘露醇，0.05MMES，0.03MTris和75%的乙醇；（3）使用叶绿体粗提溶液构建叶绿体细胞器包埋胶栓；（4）Et‑S裂解液结合NDS‑1体系裂解胶栓中的叶绿体细胞器；（5）通过脉冲场凝胶电泳分离纯化叶绿体基因组；（6）电洗脱回收叶绿体环状基因组；（7）利用RecBCDase体系清除电洗脱步骤中产生的断裂核酸片段。本发明所述方法可提取高纯度的Cir‑cpDNA。