本发明涉及病毒样品制备领域。本发明公开了一种灭活冷冻电镜样品制备系统及制备方法，其中系统包括：环境箱；夹持结构，所述夹持结构位于所述环境箱中，所述夹持结构用于夹持样品载网；灭活结构，所述灭活结构位于所述环境箱中，所述灭活结构用于对所述样品载网上的样品灭活；制样结构，所述制样结构至少部分设置在所述环境箱中，所述制样结构用于制备冷冻电镜样品。本发明灭活后的样品不需要进行转移操作，可直接进行后续冷冻电镜样品制备，缩短了从样品灭活到样品冷冻周期。本发明保留了样品近自然状态结构特征，避免了灭活样品在转移过程中可能发生的构象变化，而造成部分结构信息丢失，提高了对其功能评价的准确性。