本发明公开了一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，该疫苗株是以鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株的感染性克隆为骨架载体，然后将骨架载体中的毒力基因敲除，得到两种减毒疫苗株，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2023年07月05日，保藏编号为CCTCC NO：V202340和CCTCC NO:V202339。本发明的疫苗株免疫保护率达到100%，本发明解决了现有疫苗株对非靶动物具有致病性、无法有效预防鸭瘟疱疹病毒强毒株的攻击，以及保护效果不佳的问题。