本发明提供给了一种利用血清素合成褪黑素的基因工程益生菌及构建方法和应用，属于基因工程领域。针对工程益生菌底盘菌无法产生褪黑素的问题，本发明提供了一种利用血清素合成褪黑素的基因工程益生菌，所述基因工程益生菌共表达氮乙酰血清素合成酶Psmf和突变了的褪黑素合成酶基因OsCOMT(C296F和V314T)，出发菌株为大肠杆菌Nissle1917。利用本发明构建的基因工程益生菌合成褪黑素，产率可最高以达到14.7±0.6μg/mL。本发明可以用于合成褪黑素，为后续开发帮助改善熬夜人群的肠道健康问题的益生菌产品提供基础。