本申请提供了一种核酸提取试剂盒及其制备方法和应用，该核酸提取试剂盒包括预分装试剂板，预分装试剂板内装有含磁珠的裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；含磁珠的裂解结合液中含有以下成分：盐酸胍10～50％，EDTA 2～20mM，Tris 2～20mM，NP‑405～20％，无水乙醇20～50％，磁珠2～6％；洗涤液1中含有以下成分：盐酸胍10～30％，Tris 2～20mM，NP‑405～20％，无水乙醇20～60％。本申请在含磁珠的裂解结合液和洗涤液中加入NP‑40，可极大提高裂解效率并提高杂质去除率，提高了游离核酸的提取得率。本申请的核酸提取试剂盒搭配磁珠法全自动核酸提取仪使用，操作方法简单、安全，可实现对多个样本的同时提取检测，且抑制物质残留少，提高游离核酸的提取效率。